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纯化抗体
发布日期:2015/4/16      浏览:3897

 简介

制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低将直接影响试验的成败。通过不同方法制备的抗体往往与多种杂蛋白混杂在一起,为了获得成分相对单一的抗体或将抗体用于特定的用途,就需要进行抗体纯化。从成分的角度分析, 抗体分子是一类蛋白质分子,与其他蛋白质一样,它有一定的等电点、溶解度、荷电性及疏水性,可以用电泳、 盐析沉淀或其他层析技术进行分离、纯化。

纯化抗体通常用于直接检测抗原。此时抗体标记有一个易于鉴定的标记物,用于结合和检测所研究的抗原。在间接检测抗原方法中,一抗不被标记,而是用标记的二抗(一种抗免疫球蛋白抗体)来检测。一般而言,建议使用间接法。因为许多商家能够提供可靠的标记二抗,用间接法不仅省力,结果同样可靠。尽管如此,有几种方法需要标记的一级抗体。例如,在免疫染色试验中,需要研究2个或2个以上抗原的相对位置时,常需要纯化抗体并用不同标记物标记,这样能比较它们的相对位置。此时使用间接法不合适。因为间接法是用标记二抗来给未标记的一抗定位。又如,有时一抗需要标记,而该样本中又有大量无关抗体,它们能干扰对一抗的检测,此时用间接法也不合适。用鼠源性单抗对鼠组织抗原进行定位时,也会出现这种情况。此时需要纯化一抗,并直接按下述方法进行标记。

多克隆抗体的纯化

多抗的纯化是一件比较简单的事情,因为人工干预比较大,所以对实验者的操作依赖性较强。很多新手觉得这是一件比较复杂困难的工作,但是如果理解了原理,就可以自行改进实验了。多抗纯化方法比较多,过去有用盐析法纯化的,有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的,也有用冷酒精沉淀的方式纯化的,也有后来的离子交换层析和Protein A,G,A/G纯化的,但是在今天,市场上几乎所有的抗体都是通过抗原亲和纯化得到的,与其它方法相比,抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。

步骤如下:

1、介质的制备

2、抗原与填料的连接

3、连接效果的评估

4、多余位点的封闭

5、抗血清与beads的结合

6、非特异性结合的抗体的洗涤

7、洗脱

具体 操作与原理可以看看中国免疫学实验网上的详细讲解。

技术

免疫亲和纯化是另一种可能需要纯化抗体的技术。在这一技术中,抗体共价交联到一固相基质上,如交连的琼脂糖或聚丙烯酰胺微球。常用的方法是,先将抗体纯化,然后连接到通过化学方法激活而具有结合位点的微球上。此时,抗体的纯化对实验的成功至关重要。

试验

还有一种需要纯化抗体的试验,是从多克隆抗血清中分离抗原特异性抗体。多克隆血清中含有复杂多样的抗体,它不仅含有针对免疫原产生的抗体,还有血清的全部抗体。出于特定目的的需要,必须将抗原的特异性抗体分离出来。例如使用抗肽抗体时,需要分离出特异性识别肽段的抗体。通过纯化能获得特异性很高的抗体。纯化抗体的另一用途是降低本底。几乎在所有技术中,使用纯化抗体都能降低非特异性本底。产生这种效果主要是因为一方面能去除引起实验误差的污染蛋白,另一方面能精确控制实验中产生阳性信号的抗体量。使用纯化抗体不会使本底增加,因此纯化抗体可以作为所有免疫化学实验中降低本底的基本手段。

抗体的纯化通常是浓缩抗体的最简单方法。任何来源的抗体可以用蛋白A或蛋白G的纯化方法来浓缩。

尽管纯化抗体的方法较多,建议用蛋白A或蛋白G微球纯化法作为最常用的方法。这种方法效率高,能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体,而且随着商品化的蛋白A和蛋白G基质的出现,能将任何来源的抗体纯化。抗体的纯化也可采用传统的色谱法,在某些情况下非常有用。这些方法包括DEAE离子交换色谱法、硫酸铵沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A亲和柱法纯化较其他方法简单,并且纯化效果是其他方法的数倍。

 
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