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酶标记抗体的制备
发布日期:2016/6/16      浏览:5239
(一)酶标抗体的条件
1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。
2.特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
(二)酶标记方法
1.交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备:将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 
⑵ 二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml,2 500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内过夜后,加KH2 PO4,使近中性即可应用。 
2.氧化法 采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。 
(1)氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,加入5mg氢化硼钠(NaBH4),于4℃冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。上清液即为酶结合物,纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室温放置30min;③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜),使之结合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置4℃2h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。
表 戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目
 
戊二醛法 过碘酸钠法
 
一步法 二步法
标记方法 简单 较复杂 较复杂
酶利用率 2~4% 2~4% 70%酶偶联到99%抗体上
产率 <5% <5% >50%
标记抗体分子量 750万 <25万 >40万
穿入组织能力 一般
抗体活性丢失 较多
酶活性丢失 较多
染色效应 较好 较好
3.二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液,混合,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于4℃置24h~72h,再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4℃保存备用。
(一)   酶标抗体结合物的纯化 
在酶标记的溶液中,出现的是各种交联物的混合物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,其它都应该给予除去。 
1.50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶-酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。 
2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。 
(三)酶标抗体的鉴定
1.酶标抗体的活性鉴定 一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:16以上。 
2.酶结合物的定量测定 包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
(1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度,抗体与酶-戊二醛结合后OD280nm约增加6%,所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg,所以又乘以0.62)。 
(2)过碘酸钠法:IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
\
(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸ 酶标记率:OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3.酶结合物的质量标准 纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
(1)酶的催化活性。
(2)免疫学活性。 
(3)未联接的游离酶的量。
(4)未联接的原始免疫反应物的量。
(5)每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。 
(6)生化性质。
(7)酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP-IgG结合物进行酶标记免疫试验,可得到不同的试验结果,故应予重视。
            表 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价 最好 一般
酶结合量(mg/ml)  ≥1.0 ≥0.5 0.4
酶结合率(%) >30  9~10 7
酶IgG克分子比 >1.5 1.0 0.7
(五)酶标抗体的保存
分装小瓶,冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期:一般1~2年活性不变。
 
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